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科研進展

武漢病毒所/國家病毒資源庫在蜱源啟動子鑒定和蜱細胞系轉染體系研究中取得新進展

來源: 時間:2022-03-25

      2022年1月,中國科學院武漢病毒研究所/國家病毒資源庫鄧菲/沈姝團隊與英國利物浦大學蜱細胞庫合作,在Ticks and tick-borne diseases雜志發表題為“Differential characteristics of mammalian and tick-derived promoters to trigger protein expression in transfected tick cell lines” 的論文,解析了利用質粒轉染方法在兩種蜱細胞系表達外源蛋白的特性,比較分析了哺乳動物細胞系適用的商品化啟動子和4種蜱源啟動子在蜱細胞中驅動外源蛋白表達的效率,以及不同轉染試劑對該方法的影響。研究成果為利用蜱細胞系開展蜱傳病毒病原學以及與蜱互作機制的研究奠定重要的技術基礎。

      多種與人類和動物疾病相關的蜱傳病毒,如蜱傳腦炎病毒(TBEV)、克里米亞-剛果出血熱病毒(CCHFV),發熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV)、以及對豬高致病性的非洲豬瘟病毒(ASFV)等的流行,嚴重威脅人口健康,給畜牧產業帶來嚴重經濟損失。研究蜱傳病毒的生物學特性及其在媒介蜱種中的感染復制特性,將有助于深入理解蜱傳病毒潛在的傳播感染風險,對干預病毒在蜱中進行有效的感染復制有重要意義。為了解析蜱傳病毒在蜱中的感染復制特性以及與蜱之間的蛋白分子互作,十分有必要利用蜱類細胞系建立體外研究模型,對開展病毒與蜱互作的初步的探索性研究,鑒定與病毒感染復制關聯的關鍵蜱類蛋白/因子提供必要的技術手段。

      目前,通過質粒轉染人/哺乳動物細胞系是研究外源蛋白與宿主細胞互作中被廣泛運用的實驗手段,已經形成了如巨細胞病毒(CMV)、猿猴病毒(SV40)、單純性皰疹病毒(HSV)等病毒來源的商品化啟動子、動物來源啟動子如雞β-肌動蛋白啟動子(CAG),以及人來源啟動子如人磷酸甘油酸酯激酶啟動子(PGK)。而蜱細胞系因其種類不多,基因組功能注釋有限,對蜱細胞系的質粒轉染和外源蛋白表達的方法和效率研究還比較有限。建立針對蜱細胞系的質粒轉染方法并高效驅動外源蛋白表達,對開展蜱傳病毒與蜱細胞關鍵蛋白和因子的互作機制研究,解析病毒在蜱細胞中的感染復制機制有重要意義。

      該研究通過分析肩突硬蜱細胞系IED8的轉錄譜,選取高表達基因上游序列作為可能的蜱來源候選啟動子,克隆至熒光素酶報告質粒并轉染到蜱細胞中,通過檢測細胞中熒光素酶的活性最終篩選到4個具有啟動子活性的啟動子(Pro3、Pro5、Pro8、Pro12)(圖1)。研究還比較分析了哺乳動物細胞系轉染中常用的商品化啟動子CMV、PKG和CAG在蜱細胞系IDE8(肩突硬蜱)中的效率,結果表明CAG啟動子驅動熒光蛋白表達效率顯著高于CMV、PKG啟動子以及4個蜱細胞來源的啟動子(圖2);還發現在蜱細胞中,哺乳動物細胞系適用的啟動子驅動外源蛋白表達水平在第3天達到峰值,而蜱源啟動子驅動外源蛋白表達水平在轉染后的第2天達到峰值,提示哺乳動物細胞系適用的啟動子與蜱源啟動子驅動蛋白表達時相有明顯差異。該研究還比較分析了3種利用不同機制將外源核酸轉染進入細胞的商品化試劑對蜱細胞系轉染質粒表達外源蛋白效率的影響,表明一種與DNA濃縮增強劑聯合作用的非脂質體轉染試劑(Effectene with Enhancer)對蜱細胞的轉染效率優于其他試劑。本研究結果為利用蜱細胞系開展蜱源蛋白功能研究,蜱細胞基因改造,解析病毒與蜱蛋白互作機制和關系等相關實驗涉及的重要技術手段提供必要參考。

      武漢病毒所/國家病毒資源庫博士后史君明為論文第一作者,沈姝青年研究員為通訊作者。該研究得到了中國科學院生物資源能力建設項目(KFJ-BRP-017-74、KFJ-BRP-017-06)、國家重點研發計劃(2019YFC1200701),英國生物技術與生物科學研究理事會項目(BB/P024270/1)的支持。

全文鏈接:https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2022.101906

 

圖1  蜱來源的4個啟動子在IDE8和IRE/CTVM19蜱細胞系中啟動熒光素酶表達與活性檢測

 

圖2 蜱來源啟動子與哺乳動物細胞常用啟動子在到IDE8細胞中驅動外源蛋白表達活性比較

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